光學顯微鏡的觀察方式中,熒光觀察是一種重要且廣泛應用的技術。以下是對熒光觀察的詳細介紹:
一、熒光現(xiàn)象與原理
熒光是一種光致發(fā)光現(xiàn)象,指的是某些分子在吸收特定波長的光線(激發(fā)光)后,能夠再發(fā)射出其他波長的光線(發(fā)射光)。這種分子被稱為熒光團,其激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間存在差值,發(fā)射光能量比激發(fā)光低,波長比激發(fā)光長,這個差值稱為“斯托克斯位移"。熒光現(xiàn)象包括自發(fā)熒光與繼發(fā)熒光兩種,自發(fā)熒光是指樣品自帶熒光團,經(jīng)照射后就能發(fā)出熒光,如葉綠體;繼發(fā)熒光也稱二次熒光,樣品經(jīng)照射后不能發(fā)出熒光,需先用熒光染料標記處理,再經(jīng)照射才能發(fā)生熒光。熒光顯微鏡主要利用的是繼發(fā)熒光。
二、熒光顯微鏡的構造與部件
熒光顯微鏡是利用熒光特性進行觀察、成像的光學顯微鏡,其構造主要包括以下幾個關鍵部件:
熒光光源:用于提供熒光激發(fā)光,核心規(guī)格是光譜特征波長,要求能覆蓋染料的激發(fā)特征波長,并提供足夠光強。常用的熒光光源有汞燈、氙燈、金屬鹵素燈以及LED熒光光源。其中,LED熒光光源在開關性能、使用壽命、光強可控性和免維護等方面具有顯著優(yōu)勢。
熒光激發(fā)塊:一組激發(fā)塊由激發(fā)濾光片、發(fā)射濾光片和二向分光鏡組成。激發(fā)濾光片只讓特定波長激發(fā)光通過,用以激發(fā)特定熒光染料;發(fā)射濾光片匹配熒光染料特性,只讓特定波長的發(fā)射熒光通過;二向分光鏡反射激發(fā)波段的光,透過發(fā)射波段的光。熒光激發(fā)塊的作用是篩選特定的激發(fā)光和發(fā)射光,透過目標熒光信號。
熒光臂/熒光模塊:用來安裝熒光光源和激發(fā)塊的載體,核心規(guī)格是通道數(shù)和光源接口,影響配件適配和擴展性。
此外,熒光顯微鏡還可能配備有外置快速轉(zhuǎn)輪等部件,以實現(xiàn)高速多色實驗。
三、熒光顯微鏡的應用
熒光顯微鏡廣泛應用于細胞生物學、神經(jīng)生物學、植物學、微生物學、病理學、遺傳學以及醫(yī)療診斷、產(chǎn)業(yè)應用等領域。其具體應用包括:
生物學研究:借助熒光染料標記,熒光顯微鏡可準確而詳細地識別細胞和亞微觀細胞成分和活動,如細胞和亞微觀細胞結構、細胞生理、動物生理病理等。
醫(yī)療診斷:熒光顯微鏡可用于原位熒光雜交技術(FISH)檢測癌癥、呼吸道病毒檢測、真菌鏡檢等。
產(chǎn)業(yè)應用:在材料科學領域,熒光顯微鏡可用于檢測礦物、紡織、紙張等材料的成分;在藥品檢測方面也有重要應用。
四、熒光顯微鏡的成像優(yōu)勢
熒光成像具有高靈敏度和高特異性的優(yōu)點,非常適合進行特定蛋白、細胞器等在組織及細胞中的分布的觀察,共定位和相互作用的研究,以及離子濃度變化等生命動態(tài)過程的追蹤。此外,熒光顯微鏡還可實現(xiàn)活體、離體、標記、自發(fā)等多種方式的熒光成像,對樣本限制較少。
五、熒光顯微鏡的注意事項
在使用熒光顯微鏡時,需要注意以下幾點:
選擇合適的熒光染料:熒光染料的選擇應基于其激發(fā)和發(fā)射光譜特性,以及與目標樣本的兼容性。
優(yōu)化光源和濾光片:確保熒光光源的光譜特征波長能夠覆蓋染料的激發(fā)特征波長,并選擇合適的濾光片以匹配染料的激發(fā)和發(fā)射光譜。
控制光毒性與熒光染料毒性:在生物學領域的熒光成像中,需考慮光毒性與熒光染料毒性對樣本的影響,如細胞內(nèi)的有機分子在與氧反應時吸收光發(fā)生分解并產(chǎn)生自由基,部分熒光染料本身也能產(chǎn)生自由基,這是引起細胞等生物樣本損傷的主要來源。
綜上所述,熒光觀察作為光學顯微鏡的一種重要觀察方式,在生物學、醫(yī)學以及產(chǎn)業(yè)應用等領域具有廣泛的應用前景和重要的研究價值。