暗場顯微鏡是一種利用傾斜照明來增強(qiáng)樣品在正常照明條件下成像不佳的對(duì)比度的技術(shù)。

在直射光被聚光鏡中的不透明光闌遮擋后，從傾斜角度穿過樣品的光線被衍射、折射并反射到顯微鏡物鏡中，以形成疊加在深色背景上的標(biāo)本的明亮圖像。

這種深色背景提供了高對(duì)比度，并且可以使具有復(fù)雜背景的標(biāo)本以相對(duì)較少的工作量脫穎而出。

暗場顯微鏡如何工作？

暗場照明需要阻擋通常穿過標(biāo)本和標(biāo)本周圍的大部分光線，只允許傾斜光線與標(biāo)本相互作用。

一個(gè)簡單的阿貝暗場聚光鏡的頂部透鏡是球形凹面的，允許從頂部透鏡表面出現(xiàn)的光線形成一個(gè)倒置的空心錐形光，焦點(diǎn)集中在標(biāo)本平面上。在沒有樣品且聚光鏡的數(shù)值孔徑大于物鏡的地方，傾斜光線會(huì)相互交叉并錯(cuò)過物鏡，使這些區(qū)域變暗。

當(dāng)將標(biāo)本（特別是未染色的、不吸光的標(biāo)本）放在載玻片上時(shí)，傾斜光線會(huì)與標(biāo)本相互作用，并被樣品中的元素（如細(xì)胞膜、細(xì)胞核和內(nèi)部細(xì)胞器）衍射、反射和/或折射。這允許這些微弱的光線進(jìn)入物鏡，就能呈現(xiàn)出黑色背景上的明亮標(biāo)本。

暗視野顯微鏡需要哪些組件？

幾乎任何明場實(shí)驗(yàn)室顯微鏡都可以輕松轉(zhuǎn)換以進(jìn)行暗場照明。簡單的方法是用專為暗場照明設(shè)計(jì)的聚光鏡關(guān)閉當(dāng)前的聚光鏡。

這些聚光鏡相對(duì)簡單，并提供創(chuàng)建暗場的錐形照明所需的高數(shù)值孔徑（NA）。然而，基于照明類型切換聚光鏡對(duì)于日常顯微鏡使用是不切實(shí)際的。幸運(yùn)的是，有一個(gè)解決方法。

許多聚光鏡可以容納能產(chǎn)生錐形照明的內(nèi)插件。這些內(nèi)插件的數(shù)值孔徑不能像專用暗場聚光鏡那樣高，因此并非所有物鏡都可以使用。但是，內(nèi)插件使您可以靈活地在同一聚光鏡上使用多種觀察方法。

為什么暗場顯微鏡是一種很好的成像技術(shù)？

一般來說，在適當(dāng)?shù)陌祱稣彰鳁l件下成像的物體非常壯觀。通常，在明場顯微鏡中固有對(duì)比度非常低的標(biāo)本在暗場中閃耀出明亮的光芒。

暗場照明適合顯示輪廓、邊緣、邊界和折射率漸變。暗場照明的理想適用對(duì)象包括微小的活水生生物、硅藻、小昆蟲、骨骼、纖維、頭發(fā)、未染色的細(xì)菌、酵母、組織培養(yǎng)中的細(xì)胞和原生動(dòng)物。

非生物標(biāo)本包括礦物和化學(xué)晶體、膠體顆粒、粉塵計(jì)數(shù)標(biāo)本以及含有小夾雜物、孔隙率差異或折射率梯度的聚合物和陶瓷薄片。

不幸的是，暗場照明對(duì)于揭示內(nèi)部細(xì)節(jié)不太有用。如果您想充分利用暗場照明，還需要考慮其他條件。

使用暗場顯微鏡的挑戰(zhàn)是什么？

在為暗場顯微鏡準(zhǔn)備標(biāo)本時(shí)要小心，因?yàn)槲挥诮裹c(diǎn)平面上方和下方的特征會(huì)散射光并導(dǎo)致圖像退化。在成像時(shí)，載玻片的清潔度是一個(gè)重要因素，但在暗場中更為重要，因?yàn)槊恳粔K碎片都會(huì)被照亮，并可能帶走您想要看到的東西。

在設(shè)置暗場顯微鏡時(shí)，您可能面臨的其他挑戰(zhàn)包括：

·照明不足以使標(biāo)本可見，或者試樣可見但非常微弱。

暗場顯微鏡需要大量的光線才能正確成像，因?yàn)槠渲泻芏喙饩€都被阻擋以形成錐體。因此，不要猶豫，打開電源，但請(qǐng)注意，有些樣品可能不喜歡長時(shí)間照在它們上面的光量。

·載玻片在視野中心有一個(gè)黑點(diǎn)，但外圍的物體照明良好，看起來正常。

這通常是在聚光鏡未正確對(duì)準(zhǔn)或聚焦時(shí)引起的。對(duì)聚光鏡進(jìn)行對(duì)中和聚焦能解決這個(gè)問題。這個(gè)操作適用于照明不均勻但樣品在焦點(diǎn)處的大多數(shù)問題。

·顏色顯示在背景中，或者背景不均勻地亮起，并帶有灰色色偏。

這通常是由于樣品太厚或安裝在受污染的介質(zhì)中造成的。重新裝入樣品應(yīng)該會(huì)有所幫助。

使用暗場顯微鏡的優(yōu)勢是什么？

暗視野顯微鏡具有許多優(yōu)點(diǎn)。其深色背景提供了高對(duì)比度，可以很容易地在復(fù)雜的背景上看到標(biāo)本。這種技術(shù)很容易實(shí)現(xiàn)，因?yàn)樵S多明場實(shí)驗(yàn)室顯微鏡可以配置為暗場照明。除了顯微鏡的好處之外，暗場圖像甚至可以看起來像藝術(shù)品，樣品被精美地照亮。